基因型
MATα,ura3-52,his3-200,ade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,met–,MEL1
产品说明
Y1HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株,MATα型,可直接转化质粒进行筛库试验。Transformationmarker为:ura3,leu2;报告基因为:AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA酵母单杂系统需要两种质粒配套使用:pAbAi和PGADT7。质粒pAbAi的筛选标志为URA,用于表达pBait-AbAiconstruct(1~3个baitDNA序列重复串联后克隆到pAbAi中);质粒PGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4C端768~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA酵母单杂系统原理:AureobasidinA(AbA)是一种环酯肽抗生素,在低浓度(0.1-0.2ug/ml)下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了pBait-AbAi的酵母菌株(Bait-ReporterYeastStrains),当猎物蛋白(Prey)结合到诱饵序列(BaitDNA)上,GAL4AD就会激活AbAr的表达,从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长。AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点,可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,经pAbAi质粒检测转化效率>103cfu/μgDNA。
操作方法
1.取pBait-AbAi质粒5ug,BstBI或BbsI酶切1小时,回收。
2.取100μl冰上融化的Y1HGold感受态细胞,依次加入预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5ug(体积不高于15ul),CarrierDNA(95-100度5min,快速冰浴,重复一次)10ul,PEG/LiAc500ul并吸打几次混匀,30度水浴30分钟(15min时翻转6-8次混匀)。
3.将管放42度水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。
4.5000rpm离心40s弃上清,ddH2O400ul重悬,离心30s弃上清。
5.ddH2O50ul重悬,涂SD/-Ura平板,29℃培养72h。
6.挑取5-10个克隆,用PCR方法确定pBait-AbAi整合到Y1HGold基因组中,PCR阳性菌株在SD/-Ura平板划线,29℃培养72h,4℃保存,此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。
PreparationofMedia:
YPDA(1L):
Tryptone20g
yeastextract10g
0.2%adenine15ml
补水到950ml,用盐酸调PH到6.5
Agar20g(forplatesonly)
121度,15分钟高压灭菌,
待培养基温度降到55度时,加
入已过滤的40%葡萄糖50ml
0.2%adenine(1L)
Adenine2g
补水到1L
溶解后高压灭菌
或0.22um滤膜过滤除菌
注意事项
1.感受态细胞最好在冰上融化。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y1HGold酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,Y1HGold的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylaminoimidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。