基因型  

Ach5(rifR)TipAL4404(strepR)Octopine  

产品说明  

LBA4404菌株为Ach5型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。pAL4404型Ti质粒含有筛选标签：strep，赋予LBA4404菌株链霉素抗性，适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作。LBA4404电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒(size:11633bp)检测转化效率可达104cfu/μg；经pCAMBIA2301-ZH质粒（size:40kd）检测转化效率可达103cfu/μg。  

操作方法  

1.0.2cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。  

2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1-5ug质粒DNA（质粒体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200ul枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。  

3.启动电转仪，设置参数：C=25uF，PC=200ohm，V=2400V（此参数为Biorad推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700ul无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。  

4.6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50ug/mlkan时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50ug/mlkan，20ug/mlrif时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50ug/mlrif则需要28℃培养72-90h）。  

注意事项  

1.感受态细胞最好在冰上融化。  

2.混入质粒时应轻柔操作。  

3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。