基因型
C58(rifR)TipEHA101(pTiBo542DT-DNA)(kanR,strepR)Nopaline
产品说明
EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101(pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101(pTiBo542DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：strep、kan，赋予EHA101菌株链霉素抗性和卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作，经pK7WGF2质粒检测转化效率可达104cfu/μgDNA。
操作方法
1.取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2.每100μl感受态加1μg（体积不大于10μl）质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3.加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2~3小时。
4.6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
1. 2. 混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
4. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。
1、农杆菌相关抗生素配方：
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抗生素
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配方
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原液浓度
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工作浓度
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羧苄青霉素 (carb)
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双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
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50 mg/ml
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50 μg/ml
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硫酸卡那霉素 (kan)
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双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
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50 mg/ml
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50 μg/ml
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链霉素 (strep)
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双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
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10 mg/ml
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50 μg/ml
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利福平 (rif)
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DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
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10 mg/ml
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20 μg/ml
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庆大霉素 (gent)
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双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
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20 mg/ml
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40 μg/ml
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2、常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
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农杆菌菌株
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羧苄青霉素(carb)
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链霉素(strep)
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利福平(rif)
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庆大霉素(gent)
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硫酸卡那霉素(kan)
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AGL-1
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R
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R
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R
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S
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S
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EHA101
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S
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R
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R
|
S
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R
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EHA105
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S
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R
|
R
|
S
|
S
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LBA4404
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S
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R
|
R
|
S
|
S
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GV3101
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S
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R
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R
|
R
|
S
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3、LB及YEB配方：
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component
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LB(液体)/L
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LB(固体)/L
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component
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YEB(液体)/L
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YEB(固体)/L
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Tryptone
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10 g
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10 g
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Tryptone
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5 g
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5 g
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Yeast extract
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5 g
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5 g
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Yeast extract
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1 g
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1 g
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NaCl
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10 g
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10 g
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牛肉浸膏
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5 g
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5 g
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NaOH
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调PH到7.0
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调PH到7.0
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蔗糖
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5 g
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5 g
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Agar
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－
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15 g
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MgSO4*7H2O
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0.49 g
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0.49 g
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|
|
NaOH
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调PH到7.0
|
调PH到7.0
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|
|
|
|
Agar
|
－
|
15 g
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产品名称：