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细胞免疫检测技术介绍
点击次数:438 发布时间:2009-05-27
 

特异性细胞免疫是由T细胞介导的,因此,细胞免疫检测通常是检查T细胞的数量、功能及其产物如细胞因子等,是了解机体细胞免疫状态的重要手段。
一、淋巴细胞的分离
细胞免疫检测首先要从人或动物血液及组织中分离出活的淋巴细胞。分离淋巴细胞的方法有多种,目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离外周血单个核细胞。
分离人外周血单个核细胞(PBMC)的分层液是比重1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。
【材料】肝素抗凝人血、淋巴细胞分层液、无Ca2+ 、Mg2+ hanks液、离心管、试管、吸管、毛细管、白细胞计数板。
【方法】
(1)采取新鲜静脉血2ml,加入含0.1ml肝素(50单位)的试管中,加2mlhanks液混匀。
(2)用滴管将稀释过的血液沿管壁缓慢加入2ml细胞分层液的液面上(分层液与稀释血液体积比例为1:2),注意两者不能混合,保持界面清楚,用水平离心机以2000转/分,离心20分钟,离心完,可见红细胞沉降至最下层,上层为血浆,中层为分层液,血浆与分层液的界面有一比较清楚的乳白色淋巴细胞和单核细胞层(见图4-1)。用毛细滴管吸取该层,置含有1滴肝素及5倍以上体积无Ca2+ 、Mg2+ Hanks液的试管中,以2000转/分离心10分钟,弃上清液后,以同样试液再洗涤一次。
(3)尽量吸去上清液,将沉于管底的细胞沉积块摇散,加Hanks液至1ml作细胞计数,用Hanks液配成2×106细胞/ml的细胞悬液。


二、E花环形成试验(erythrocytc rosette forming test)
人类T淋巴细胞表面CD2分子是绵羊红细胞(SRBC)受体,也称E受体,在一定条件下,SRBC环绕T细胞与之结合,形成花环状,称E花环(E-rosette),形成此种花环的细胞称E花环形成细胞(简称E-RFC)。
E花环试验可用作人外周T细胞的分离与鉴定。
【材料】淋巴细胞悬液、1%SRBC悬液、灭活之小牛血清、离心管、试管、吸管、载玻片、0.8%戊二醛、瑞氏染液。
【方法】
(1)取上述配好之淋巴细胞悬液0.1ml于洁净小试管中,加入1%SRBC悬液0.1ml。再加入小牛血清0.1ml,混匀,置37℃水浴箱中5分钟,500转/分,离心5分钟,放4℃冰箱2-24小时。
(2)从冰箱中取出试管,留适量上清液,轻轻摇匀,加0.8%戊二醛2滴,轻摇后,置4℃冰箱15分钟,取出,作成涂片,待自然干燥,以瑞氏染液染色。
(3)计数:镜下观察,凡结合三个以上SRBC的T细胞即为E-RFC,计数200个淋巴细胞,求出E-RFC占淋巴细胞总数的百分率。
【结果】
一般认为E-RFC的正常值在60%以上,如少于50%则为低下。如欲分离T细胞,可用密度梯度离心,E-RFC因比重增大而沉于管底,与其他细胞分离;用低渗法裂解花结中的SRBC,即可获得纯化的T细胞。
三、淋巴细胞转化试验(微量全血法 )
T细胞在体外培养时,当受到非特异性的有丝分裂原(PHA)刺激后可转化为淋巴母细胞,并进行有丝分裂,转化的淋巴母细胞,在形态上出现了幼稚化,光镜下很容易识别,可通过淋巴细胞转化率反映机体T细胞免疫功能。此试验也可用3H-TdR掺入法或MTT法定量检测。

 
 
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