DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的目的是学习植物基因组dna提取方法、原理和DNA的鉴定技术。
Ⅰ 植物基因组DNA 的提取(CTAB法)
一、原理
植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白(即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：
(1)DNA的二级结构和双链易受多种因素(如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等)的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。
(2)抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作;b、调节pH，使偏碱(pH8.0);c、抽提液中加表面活性剂;d、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+)，使酶活性丧失。
(3)防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。
(4)防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。
(5)植物的次生代谢物(主要是胞质内的多酚类或色素类化合物)对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。
分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。
二、实验材料、仪器及试剂
1、仪器
水浴锅：混匀器;高速冷冻离心机;移液器;754紫外分光光度计;液氮罐;水平电泳槽;电泳仪
2、材料与药品
水稻幼苗
液氮：吸头、小指管;氢氧化钠;溴代十六烷基三甲胺(CTAB);三羟甲基氨基甲烷(Tris);氯仿;乙醇;RNA酶;蔗糖;溴酚蓝;异戊醇;β-巯基乙醇;盐酸(HCl);异丙醇;乙二胺四乙酸(EDTA)
3、 试剂
(1)DNA提取液
100mmol/L Tris,
20mmol/L EDTA,
20g/L NaCl
1.4mol/L NaCl
pH8.0
(2)异丙醇(-20℃预冷)
(3)溶液I：氯仿异戊醇(24：1)
(4)5×TBE缓冲液
0.45mol/L Tris·H3BO3
0.5mol/L EDTA(pH8.0)
(5)TE缓冲液
10mmol/L Tris·HCI
1mmol/L EDTA(pH8.0)
(6)75%乙醇 (放-20℃冰箱中，用后即放回)
(7)RNA酶
将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCI(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成
10mg/mL的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
(8)上样缓冲液：40%蔗糖、0.25%溴酚蓝
三、操作方法
(1) 取200mg样品(在液氮中研磨成粉末状)放入1.5mL离心管中，加入600μL DNA提取液，颠倒混匀5-6次。65℃保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。
(2)再加等体积的氯仿异戊醇(24：1)溶液轻轻摇晃30秒，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，取吸上清液(450μL)
(3) 再加两倍体积的预冷异丙醇，混匀静止10分钟以上，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，弃上清。
(4) 用600μL70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。
(5)沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50μg/mL，在37℃下保温半小时，将DNA样品放入冰箱保存。 |
