利用dna连接酶把目的DNA片段和载体DNA连接在一起，成为一个新的重组分子。目的DNA片段被限制酶消化后其末端只可能有3种形式：

 

(1)带有相同的粘性末端：用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。由于质粒载体也必须用同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外源目的基因片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化，而且正反两种连接方向都有。为防止载体DNA自身环化，在连接前需除去载体分子的5’-P，使之最大限度地抑制载体环化现象。

 

(2)带有非互补的粘端：用两种不同的限制酶进行消化可以产生这样的末端、一般情况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同的酶单酶切位点;用两种酶分别消化载体和目的DNA后，可将外源目的片段定向克隆到载体上。

 

(3)带有平末端：由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由dna聚合酶Klenow片段补平3’凹陷，使不相匹配的末端转变为平端。

 

成功的连接反应需纯净的目的dna片段和载体DNA一般采用插入片段(目的DNA)与载体DNA分子数比为3～5：1。目的基因比例太多，易产生基因自连后插入载体的多聚体。根据插入片段和载体的分子量大小计算连接反应体系中需要加入的各DNA片段含量，计算公式如下：

 

DNA体外连接实验方法

【器材】

 

1.水浴箱

 

2.eppendorf 管

 

3.离心机

 

【试剂】

 

1.T4 DNA连接酶/10×T4 连接酶缓冲液

 

2.牛小肠碱性磷酸酶(CIP)/10×CIP缓冲液

 

3.0.5mol/L EDTA

 

【操作步骤】

 

1.建立下列去磷酸基团的反应体系：

 

10×CIP 缓冲液 2μl

 

线性化载体(已酶切) 10μl

 

CIP 1μl

 

ddH2O 7μl

 

2.37℃水浴 1h。

 

3.加入2μl 0.5mol/L EDTA, 65℃灭活 15min。

 

4.经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，TE溶解DNA。

 

5.在Ep 管中建立连接反应体系：

 

10×连接缓冲液 2μl

 

DNA片段(0.2μg) 　　 2μl

 

线性化的载体DNA(0.1μg) 2μl

 

T4DNA连接酶 1μl

 

ddH2O 13μl

 

6.混匀，16℃反应数小时(5-12h)。