一. Total RNA的提取 
二. mRNA的分离 
三．cDNA双链合成 
四．载体制备 
五. cDNA双链和载体的连接 
六．电转化流程 
七．快速鉴定、菌落PCR 
八．pBlueScript cDNA库扩增 

一.Total RNA的提取 

(一)试剂配制 
准备工作： 
1.研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 
2.50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。 
3.电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 
4.常用试剂及其配方： 
▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 
三水合柠檬酸纳 22.94g 
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 
▲10%肌氨酸钠： 
肌氨酸钠 10g 
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 
▲变性裂解液： 
0.78M柠檬酸钠 8.25ml 
10%肌氨酸钠 12.375ml 
异硫氰酸胍 118.05g 
加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用 
临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） 
▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5 
NaAc·3H2O 13.6g 
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲3M醋酸钠 PH=5 
NaAc·3H2O 20.4g 
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 
▲ 4M LiCL: 
LiCL 24.164g 
加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 
▲0.5M EDTA PH=8.0 
EDTA 18.61g 
用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用 
▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸): 
MOPS 41.86g 
NaAC·3H2O 4.10g 
0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml 
用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。 
▲1x MOPS: 
10x MOPS 30ml 
加DEPC水270ml，用时现配。 
▲4x RNA Loading buffer: 
10x MOPS 400ul 
甘油（高压过） 200UL 
溴酚兰 10ul 
甲醛(37%) 72ul 
去离子甲酰氨 310ul 
EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul 
ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 
在4℃ 可保持3个月 
▲10x PBS 
pH=7.4 
NaCl 80g 
KCl 2g 
Na2HPO4 14.4g 
KH2PO4 2.4g 
定容至 1000ml