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从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤
点击次数:624 发布时间:2015-12-28
 

提取DNA需要的仪器和试剂: 
⑴ 1.5ml 离心管 
⑵ 移液管: 1000ul, 200ul, 40ul 各一支和移液管尖头: 100-1000ul, 1-200ul 各一盒 
⑶ 微型滤柱(备用) 
⑷ 小型旋转混合器一台 
⑸ 小型离心机: 可放入1.5ml 离心管和2ml收集管. 
⑹ 恒温水浴 
⑺ 电冰箱: -20℃, 4 ℃
⑻ 无水乙醇(自备) 
⑼ 70% 乙醇(自备) 
⑽ dna提取试剂盒。内含: ⑴ 裂解液1 ⑵ 裂解液2 ⑶消化液 ⑷纯化液 ⑸弥散液 ⑹蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干。 

 

一.从1ml全血或体液中提取DNA的步骤: 
⑴ 裂解1: 取1ml全血,血桨,血清,淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中,加入400ul裂解液1。上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动15秒后放入离心机中离心,离心速率为8000rpm,1min.。倒掉上层液,可见离心管底部有血色沉淀。重复此裂解步骤一次,这次是加入1ml裂解液1。 最后用移液管吸净所有上层液弃去, 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。 
⑵ 裂解2: 在上面离心管中加入1ml裂解液2。上下翻转,务必使沉淀物分散, 旋转脉动15秒后放入离心机中离心,8000rpm,1 min.。 倒掉上清液,可见离心管底部有微量淡红色沉淀。重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入1ml裂解液2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。 
⑶ 消化: 吸取蛋白酶k 10ul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打, 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后, 加入320ul消化液,上下翻转离心管, 务必使沉淀物分散于消化液中。放入58℃水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。 
⑷ 纯化:在上面的消化液体中加入110ul纯化液, 上下翻转离心管几下后, 离心,速率为15000rpm, 1min, 把上清液吸出放入到装有1000ul无水乙醇的1.5ml离心管中,轻轻上下翻转10次, 可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到100ul 70%乙醇中耒回漂洗20次,钩出DNA,在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4℃,过夜, 使之充分弥散后使用。提取完毕。 
如要立即用此DNA做PCR实验,把DNA弥散液放在58 C水浴中,保温30分钟, 用手指拍打离心管子,使DNA弥散后使用。提取完毕

⑸ 收集:(在DNA极少量, 不能用带钩玻璃棒挑起的情况下) 把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中, 滤器放入离心机内,离心: 8000rpm , 1 min.. DNA便附着在滤漠上,弃去滤液,把滤柱放回收集管上。 
⑹ 吸取200ul 70%乙醇于滤柱内,离心8000rpm ,1min, 弃去滤液。把滤柱放回收集管上,再心 15000rpm ,1 min.. 使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。 
⑺ 回收DNA: 把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml 离心管中。 吸取100ul 已温热到58 C的弥散液,轻轻放入滤膜的表面, 保温58 C静置10分钟。 离心 8000rpm ,1 min.,DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。

 
 
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