(2)所得DNA应当完整,电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型。
(3)所得的DNA应有足够的量。例如,要研究多个遗传标记在某一植物居群中的分离情况,也许就要求从单株植物中提取的DNA可作100次分析;而在从大量植株中筛选一个单一遗传标记时,只需在一个eppendorf管中微量提取得到的DNA就绰绰有余了。
如果是对植物进行大规模筛选,还应当满足下面这项要求:操作程序应当快速、简便、价格低廉,并尽可能避免使用有毒试剂。
有关植物DNA提取步骤的原理,本节将从众多的DNA提取方法中,结合本实验室的体会,选择CTAB法作一简介。CTAB(cetyltriethy lammonium bromide)是一种去污剂,这种方法的原理是:一定浓度的CTAB与核酸结合并通过离心形成CTAB-核酸复合物沉淀,而多糖等留在上相中。要使CTAB-核酸复合物的分开则先溶于高盐溶液中,再用乙醇沉淀核酸,CTAB溶于乙醇中。所得核酸DNA大小为20~50kb。很少有RNA干扰,必要时也可用RNase去除残留RNA。无论是新鲜材料或经脱水处理的材料,本方法均适用。
1.1 试验条件
【药品试剂】
抽提缓冲液(2×):
CTAB(W/V) 2%
Tris-HCl(pH8.0) 100 mmol/L
EDTA 20 mmol/L
NaCl 1.4 mol/L
巯基乙醇 2%
10%CTAB溶液:
NaCl 0.7 mol/L
CTAB 10%
沉淀缓冲液:
CTAB 1%
Tris-HCl(pH8.0) 50 mmol/L
EDTA 10 mmol/L
巯基乙醇 1%
CsCl梯度溶液(每梯度):
CsCl 25 g
TE缓冲液(pH8.0) 25 ml
溴化乙锭(EB) 5 mg/ml
TE缓冲液:
Tris-HCl(pH8.0) 10 mmol/L
EDTA 1 mmol/L
异丙醇溶液:向装有一定量异丙醇的瓶中加入TE缓冲液直至两相出现,然后边搅拌边加入固体CsCl,至下层TE相中出现白色沉淀,两相混匀待用
液氮
氯仿/异戊醇(24/1)
异丙醇
2%巯基乙醇 |