实验目的: 了解植物DNA抽提的主要方法,掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。
实验材料及试剂:水稻叶片,1.5×CTAB,氯仿/异戊醇(24:1),95%乙醇或无水乙醇等
实验原理:植物DNA的抽提常采用两种方法:
(1)SDS法: 离子去污剂,过程长,纯度高;
(2)CTAB法:该方法简便、快速,DNA产量高(纯度稍次,适用于一般分子生物学操作)。 CTAB是一种非离子去污剂,植物材料在CTAB的处理下,结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后,CTAB-核酸复合物再用70-75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
实验步骤:
1.采集适量幼嫩叶片,用液N2研成粉末,0.4 g装入1.5ml离心管中(-20℃预冷)。
2.预热1.5×CTAB到95℃,加1ml到装有叶片粉末的离心管中,混匀(防止冻融)。
3.立即置于65℃水浴30min,每5分钟,上下颠倒1次。
4.12000g离心5分钟。
5.吸取上清液约600µl,加入等体积(600µl)氯仿/异戊醇(24:1),上下颠倒数次,至下层液相呈深绿色为止。
6.12000g离心5分钟。
7.取450µl上清于一新1.5ml离心管,加入1ml 95%乙醇和45µl 10M NH4AC),混匀,室温放置10min。
8.12000 g离心10min,去上清,用75% EtOH浸洗沉淀,自然干燥约30 min。
9.加入50µl 1/10 TE或无菌水(含20µg/RNase),置于4℃过夜,待DNA溶解后,检测DNA浓度及质量。
注意事项:
1.尽量取材幼嫩叶片,如太老,酚类物质多,必须用10 mM的β-ME处理
2.研钵预冻,粉末至加CTAB前不要融化
3.24:1的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔,转移用的枪头最好是剪宽了的
4.所用试剂必需灭菌,手套 |