液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存.
TB溶液*TRANSFORMATION BUFFER
PIPES 3.0G 10mM
CaCl2.2H2O 2.2g 15mM
KCl 18.6g 250mM
add water up to 950ml
用 5N KOH 调PH至6.7-6.8*低PH不溶
在加终浓度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g
定溶到1升, 过滤灭菌, 4度保存.
但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒.
【zihudie】
（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。
（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。
（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（5）重复第4步操作。
（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。
本法效率极高,建议大家采纳
【yog】
1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。
以下为转贴，具体方法请最好查阅文献。
E.coli感受态细胞制备方法:
单菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600
=0.2-0.4
离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作.
转化: 加质粒(〈5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42oC 90秒，冰上2分钟，加LB至1ml
, 37oC 1小时后铺抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O |
