冻存细胞：

补充新的培养液 – 在您开始冻存细胞的前一天补充新的培养液。

在细胞长至70%单层时收获细胞，计数活细胞数，用冻存液调整细胞密度 ~5 x106 Cells/ml (根据不同的细胞类型调整)

冻存液 – 用冻存液洗细胞并用冻存液重悬细胞，有不同类型的冻存液，根据细胞类型选择最合适的冻存液(常用的冻存液成分有):

– 5-10% DMSO – 注意确保DMSO不含有其他的毒性物质.

– 5-15% 甘油

– 如果细胞在无血清培养基内生长，应在50%条件培养基内(细胞在无血清培养基内生长24小时)内冻存和复苏。

在冻存管上标记好细胞类型，日期，冻存人等信息，并保证每冻存管不超过1.5ml.

程序降温是保证冻存细胞活性的关键，使用 Mr. Frosty(找生物注一种装置)保证降温速度为1°-3°C，置于-80°C冰箱内过夜，如果没有Mr. Frosty装置，可以使用实验室常见的泡沫盒、棉花等(原文是实验室尿布，呵呵，不知道是什么鸟).

放入液氮罐之前记录冻存管的数量和位置。以最快的速度转移冻存管知液氮罐内，因此，此步骤最好使用干冰，或者把冻存管浸入装有液氮的小盒内。此外还要注意，在冻存管上没有足够的空间记录细胞的详细信息，做好记录是非常非常重要的!

还有一个最重要的，一定要在异地的液氮罐内保存同样的一份细胞，以免其中的一个液氮罐出现问题!

细胞复苏-正确的复苏方式和正确的冻存方式同样重要，熟记以下要点：

当从液氮罐内取出细胞时，有可能会出现冻存管破裂的情况，使用保护面罩和防护服十分必要(找生物注国内这个方面做得非常不好吧)

从液氮内转移冻存管至热的(温度高的)容器内，应在液氮内完成(?)

应该与37℃水浴中快速溶解冻存的细胞，并保证冻存管盖子在水面之上以避免污染。当最小的冰块溶解后，用70%酒精擦拭冻存管，并迅速转移至新的已经预热的培养基内。

观察细胞生长形态和生长比率。

其实，细胞复苏只是一个简单的实验，不过这其中却不可避免有一些需要注意的细节，不然，也不一定会尽如人意。例如说，人身健康方面：一定要记得做好防冻工作，戴上护目镜;尽量降低DMSO对细胞的损伤等等。